adsbiotec mRNA聚（A）尾蛋白中的磷酸二酯修飾簡介

不影響蛋白質表達的去烯基化

多米尼卡·斯特澤萊卡，1,3米羅斯勞·斯米坦斯基，2,3帕維爾·J·西科爾斯基，2馬辛·沃明斯基，1
1歲的喬安娜·科瓦爾斯卡和2歲的雅切克·杰米利特
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波蘭華沙02-093華沙大學物理系實驗物理研究所生物物理系
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華沙大學新技術中心，波蘭華沙02-097
摘要化學修飾使mRNAs的制備具有更高的穩定性和翻譯活性。在本研究中，我們探索了mRNA體和聚（A）尾中5′、3′磷酸二酯鍵的化學修飾如何影響真核mRNA的生物學特性。為了獲得修飾和未修飾的體外轉錄mRNAs，我們使用ATP和
在α-磷酸（包含O-to-S或O-to-BH3替換）和三種不同的RNA聚合酶-SP6、T7和聚（A）聚合酶處修飾的ATP類似物。為了驗證ATP類似物在ATP存在下的摻入效率，我們開發了一種液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）方法，用于基于轉錄物*降解為5′-單核苷酸的定量評估修飾頻率。該方法還估計了平均聚（A）尾長度，因此為建立mRNA的結構-生物學特性關系提供了一個通用工具。我們發現，與未修飾的mRNA相比，在聚（A）尾中含有硫代磷酸基團的mRNA更不易被3′-dedenylase降解，并在培養細胞中有效表達，這使它們成為有用的研究工具和未來基于mRNA的療法發展的潛在候選。
關鍵詞：去烯基化；mRNA修飾；抵抗；轉錄；翻譯

由于應用分析方法的分辨率差，導致ITE長度增加，這又因多聚（A）尾異質性而變得復雜（Jalkanen等人，2014年）。最高分辨率測序方法，如TAIL-seq（Chang等人。
PAlso-seq（Subtelny等人2014年；Liu等人2019年）和FLAM-seq（Legnini等人2019年）提供了關于核苷酸序列、聚（A）尾長度和腺嘌呤修飾存在的信息。質譜分析
通過直接注入分析或結合色譜技術成功地用于RNA（包括mRNA）分析（Kowalak等人，1993年；
Gong和McCullagh 2014；Rose等人，2015年；韋策爾和林巴赫2016；Studzinska等人，2017年；Beverly等人，2018年；Lobue等人，2019年；Calderisi等人，2020年）。這種強有力的技術提供了有關RNA結構和功能的信息
組成，包括聚（A）尾長。盡管這是一種高分辨率和敏感的方法，但由于多電荷態和相關光譜的復雜性，長mRNA的分析可能很困難（Muddiman）
等人，1996年）。
在這項研究中，為了能夠分析P-mod mRNA，我們開發了一種新的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）方法，該方法能夠同時量化修飾的磷酸化核糖核酸的數量-
雙酯鍵和mRNA中聚（A）尾平均長度的估計（圖1）。隨后，我們應用該方法對攜帶硫代磷酸或磷酸硼砂修飾的IVT P-mod RNA進行了表征-
三種不同的RNA聚合酶可以使細胞大小不同。最后，對LC–MS/MS表征的P-mod mRNA進行了體外研究，以評估其對酶促脫烯基化的敏感性，并在培養細胞中評估磷酸二酯修飾對蛋白質表達的影響。我們瞥見了P-mod RNA的合成孔徑雷達，并確定了與高效蛋白質表達兼容的修飾模式。